Мультиплексування флуоресцентний генетично Barcoded клітин з метою біологічних застосувань може бути досягнуто тільки коли окремі клонових популяції були отримані. Multiplexing є найбільш ефективним, коли штрих-кодом групи населення мають чіткі різних флуоресцентних характеристик з мінімальними спектрального перекриття. У прикладі, показаному на фіг.1, з клональних популяцій ссавців SupT1 клітини показує, що Barcoded клітини з mCherry і циано флуоресцентного білка (CFP) може бути легко проаналізована одночасно без втрати їх окремі флуоресцентні властивості. Таким чином, ця матриця є прикладом панель флуоресцентних генетично Barcoded клітин, що може використовуватися для мультиплексування біологічних застосувань з відліком в ще одному додатковому доступного каналу. Для того, щоб отримати таку групу важливо пам'ятати, характер ретровірусів технології, які приведуть до змінної діапазонів флуоресцентних інтенсивності в популяції через інсерційного EFдефекти і / або МВС. Малюнок 2 ілюструє, що початкове трансдукції клітин ссавців з вірусні частинки, що містять або тд томатному або Е2 Crimson результати в клітинах, які експресують один або обидва з флуоресціюючих білків в широкому діапазоні інтенсивностей (зліва). Вибір і сортування одиночних клітин в 96-ямковий планшетах, як показано в закритих коробках (середина панелі), дозволяє отримати щільні клонових популяцій наступні розширення (праворуч). Жорсткої населення повинні бути визначені як такі, що невелику CV, які можуть варіюватися в залежності від типу клітин, як правило, 30-40%, в середньої інтенсивності флуоресценції. Малюнок 2 ілюструє також, що для подальшого збільшення числа генетично зі штрих популяцій з матрицею тільки два флуоресцентні білки, можна також використовувати інтенсивність флуоресценції. Як правило, один відхилення журналу інтенсивності флуоресценції середньої між популяціями підходить для досягнення належного поділу один від одного з сортування і amplificaнія. Td Томатний був обраний в показаному прикладі, щоб проілюструвати цю функцію, де дві популяції, що відрізняються інтенсивністю, середніх і високих, були отримані для мультиплексування з Е2 Crimson, на одному інтенсивності.
Multiplexing є потужним інструментом для полегшення аналізу багатьох зразків в той же час і за здатністю декодувати масках населення. Підвищення мультиплексування може бути досягнуто з ще третього флуоресцентного білка, такі як EGFP, до тих пір, спектральні властивості не заважають один одному. В експериментальній методиці, показаної на Фіг.3 панель з шести популяцій, отриманих з тд помідорів і E2 Темно-червоного була використана для збільшення мультиплексування з EGFP. Технологія ретровірусних був використаний для передачі EGFP для населення, представлених в одній з матриць. При спостереженні в каналі EGFP, Незеленов наївно матриця шести населення (верхня ліва панель на малюнку 3) нічим не відрізняється від EGFP-ТрансдуцірованниеМатріца населення (в лівому нижньому панель на малюнку 3). Важливо відзначити, що панелі можуть бути проаналізовані в каналах, займаних вихідного генетичного штрих-коду (TD помідорів і Е2 малиновий). У той час як невиразні в цих каналах (пор популяцій 1-6 з населенням 7-12 в середині панелі, рис 3), індивідуальний популяції можуть бути проаналізовані в каналі EGFP і декодуються і гусеничних тому, як показано на гистограммах (праворуч панелі в Малюнок 3). Після повторення процесу трансдукції, відбору, сортування та посилення, скориставшись незайнятих каналів марно, якщо право компенсації не застосовується для коригування можливої спектральної перекриття. Щоб довести це, коли їх популяції 1, 2, 3 (не зелені) і 7, 8, 9 (зелений) аналізуються в EGFP і т.д Томатний каналів, населення 7 і 8 важко відрізнити (ліва панель на малюнку 4), Таким чином, необхідно вибрати наївних клітин (населення 1) в якості негативного ConТроль так, що параметри приладів можуть бути встановлені. При аналізі будь-яку матрицю, особливо з флуорофор, що спектрально перекриваються, необхідно, що окремі управління кольором використовуються для визначення правильних значень компенсації. При аналізі рис 4 популяції 2 або 3, і 7 служать цієї мети, що дозволяє більш точно визначити популяції, які дійсно двічі позитивні (популяції 8 і 9).
Генетично Barcoded клітини з флуоресцентними маркерами зберегти свою самобутність, як це визначено їх biosignature, при аналізі в правильному флуоресцентного каналу з правого інструменту. Проте, biosignature стає просто додатковий індивідуальної власності, якщо не використовувалися для біологічних застосувань. Для того, щоб довести силу флуоресцентного генетичного штрих-кодування для мультиплексування ми вирішили представити одного з наших раніше розроблених тестів для виявлення наркотиків в деяких флуоресцентних зі штрих клітинних ліній ссавців. Роблячи таким чином, fluorescЛОР генетичний штрихове кодування було використано для досягнення трьох аналізів в одному зразку. У цій процедурі каркасний білок, що містить один з трьох передбачуваного вірусного субстрату для протеолізу переносили в генетично Barcoded клітин. В аналізі, відщеплення розкривається втрати FLAG епітопом на клітинної поверхні (фіг.5В). На відміну від цього, фарбування FLAG поверхня являє відсутність розщеплення фіг.5 показаний результат аналізу трьох різних субстратів .; ВІЛ-1 конверт дикого типу (Env вага), ВІЛ-1 конверт мутант (ENV Мут), і денге Вірус (DenV) PRM. Кожен з них був введений в 1 з 3 зі штрих клітинних ліній, наївний, і 2 інших, які використовують TD Помідор з різною інтенсивністю (середні і високі, малюнок 5А). Фарбування для експресії ПРАПОР поверхні показує, який з субстратів розщеплюється на основі відповідного штрих-коду. У прикладі тільки ВІЛ Env Mut зберігає прапор мітки (позитивне) з подальшим фарбуванням, як показано на зелений-FITC каналу (5С, прямо нижня панель). Аналіз аналізу, таким чином, здійснюється незалежно від вихідного штрих-кодування, і в подальшому використана для декодування і відстежувати назад різні групи населення. Цей спосіб мультиплексування, таким чином, залежить від додаткового каналу, зарезервованого для біологічної зчитування інтерес.
Малюнок 1:. Штрихове кодування для мультиплексування окремих популяцій, генетично штрих-кодом, використовуючи різні флуоресцентні білки, такі як mCherry, CFP або обидва (ліва панель) можуть бути змішані, проаналізовані і декодується (права панель) в своїх каналів через проточної цитометрії. Взято з Smurthwaite, С. і ін., 2014 58. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 2 :.Сортування і посилення зі штрих клітин
ссавців клітини аналізували 48 ч наступну трансдукції вірусних частинок, що містять або TD Помідор або E2-Crimson, (ліва панель). Ворота потім встановіть для сортування включити клітини, які експресують TD Помідор з різною інтенсивністю, з / без Е2 Crimson, (середня панель). Клони сортів були посилені і повторно проаналізовані, щоб створити матрицю з шести помітних груп населення (права панель). Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 3 :. Розшифровка показує масках населення матріциіз шести населення, отриманих на малюнку 2 (TD Помідор і / або E2-Crimson) можуть бути додатково розроблені, щоб висловити додаткову флуоресцентний білок, такий як EGFP. (А) вихідна матриця, при аналізі в каналі EGFP (зліва) є негативним і шість популяції відрізняються один від одного. Кожен з шести груп може бути незалежно аналізували в каналі EGFP, як показано на гистограммах (праворуч) панелей. (B) та ж матриця, в даний час висловлюючи також EGFP, була проаналізована як в A, відкриваючи тепер їх зелений флуоресцентний характеристику. Взято з Smurthwaite, С. і ін., 2014 58. Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 4: Компенсація забезпечує правильний розподіл Деякі з населення, спочатку відібраних на основі тд помідорів і / або EGFP вираження (населення 7 і 8) не може бути належним чином розділені при аналізі разом (ліва панель), якщо відповідної компенсації для цих каналів не регулюється (в порядку. панель). Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.
Малюнок 5 :. Вибір зі штрих клітин для подальшої адаптації до обраної аналізу () Вибір і адаптація до аналізі вибору. Популяції генетично штрих-кодом з тд Помідор при різної інтенсивності (верхня ліва панель) були використані для біологічних застосувань. Кожен з популяцій далі розроблені для містять аналіз, який контролює розщеплення, Але кожен з іншого субстрату (верхня права панель). (В) зображений аналізу. Позитивний FLAG пляма вказує відсутність розщеплення в той час як негативний FLAG пляма вказує розщеплення. (C) Аналіз аналізу з подальшим фарбуванням прапор. Змішані популяції помітні на основі тд Томатний штрих-код, але не відрізнятись в каналі FITC (зліва панелі). При фарбуванні з FLAG-FITC антитіла, єдина популяція є позитивним для прапора. Розшифровка показує, на основі генетичного штрих-кодування, що це населення несе ВІЛ Env матова підкладка (права панель). Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити збільшену версію цієї цифри.